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技術(shù)文章

SDS凝膠電泳

SDS凝膠電泳

一、簡(jiǎn)介
     聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸等，其作用原理為聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)*初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?。

二、SDS作用
     SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。

　　SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。

　　濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子*快，甘氨酸根離子*慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率*大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。

三、電泳原理及其過程
蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物形成近似“雪茄煙”形的長(zhǎng)橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，約為18A(1A=10的負(fù)十次方米），這樣的蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小由于蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在單位長(zhǎng)度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分離膠，進(jìn)入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會(huì)根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。

　　SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢測(cè)，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會(huì)形成分別對(duì)應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級(jí)的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時(shí)得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對(duì)于了解未知蛋白及設(shè)計(jì)提純過程都是非常重要的。

四、實(shí)驗(yàn)材料和操作方法

一．設(shè)備

　1）直流電源如果一次進(jìn)行電泳的管數(shù)在20管以內(nèi)可以用*大電流300毫安的整流器（硅或硒整流器），調(diào)壓范圍0—300伏。

　2）電泳裝置包括二個(gè)緩沖液槽和電泳管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部鉆孔。插入電泳管，用有孔橡皮塞固定。電泳管選用孔徑均勻一致的玻璃管切制。長(zhǎng)10厘米，內(nèi)徑 ^5毫米。脫色用玻璃管長(zhǎng)10厘米，內(nèi)徑8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。

　3）凝膠管架灌裝凝膠管時(shí)使管保持垂直位置，用有機(jī)玻璃制成。

二．操作方法

　1）凝膠管的制備將電泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝膠溶液（方法見下文）。每管加至液體高度為7．5厘米。為了保證凝膠表面平整可用注射器通過細(xì)針頭小心地加一層（高約1厘米）蒸餾水于表面上，勿使與凝膠液混合，室溫放置。如果條件合適溶液于 30—60分鐘內(nèi)聚合而成凝膠。凝膠溶液的配制方法如下：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重結(jié)晶）25克，雙體（甲醇重結(jié)晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要時(shí)用三羥甲基氨基甲烷調(diào)pH至7．0。溶液乙：二甲氨基丙腈l毫升，三羥甲基氨基甲烷O．85克（也可用O．625克氨三乙醇或氨乙醇）加水至100毫升。溶液丙：K3Fe(cN)6分析純0．075克，加水至100毫升新配。用作阻聚劑以延緩凝聚時(shí)間。使操作方便，如凝聚時(shí)間已足夠長(zhǎng)可以用蒸餾水代替。溶液?。哼^硫酸銨（二級(jí)）2．8克加水至 100毫升新配。必要時(shí)用氨水調(diào)pH至7．0 c，溶液甲及乙配后可在冰箱中保存數(shù)月。溶液丙及丁用時(shí)新配。臨用前將溶液甲、乙、丙、丁等量混合。

　2）準(zhǔn)備把已灌裝凝膠的玻管通過有孔椽皮塞安裝在上面液槽的底孔中，在上下兩槽內(nèi)分別注入緩沖液。裝上后電泳管下端應(yīng)浸沒在下槽的緩沖液中，管下端勿留氣泡。血清電泳可以用***緩沖液pH一8．6，離子強(qiáng)度0．05（配法：***鈉10．3克，二乙基巴比土酸1．84克，加水至1升，溫?zé)崾谷?。加硫柳汞O．1克防霉）。

　3）加樣在資料介紹的方法中，一般還在了這一步。在血清樣品中加入少量蔗糖以增加密度，用血紅蛋白吸管直接小心地加在凝膠表面上，加樣量一般為7微升血清。如果在樣品中混入少量溴酚蘭指示劑就可以在電泳過程中觀察前沿移動(dòng)的情況。

　4）電泳在二液槽中安放白金絲電極；正極在下，負(fù)極在上。接通電源進(jìn)行電泳，電場(chǎng)強(qiáng)度10伏/厘米左右，視室溫高低而定。室溫較高時(shí)宜用較低的電壓以免發(fā)熱過度影響分離。蛋白質(zhì)向正極移動(dòng)。侍染料前沿移動(dòng)至管底近處，停止電流。電泳時(shí)間為l一2小時(shí)。電泳完畢取下凝膠管，用細(xì)長(zhǎng)針頭沿管壁注蒸餾水，使凝膠與管壁剝開。然后用橡皮球壓出凝膠條。

　5）染色及脫色電泳后的凝膠條在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小時(shí)以上。染色后的凝膠條用7%醋酸洗滌數(shù)次。置于脫色玻管中，在同一電泳裝置中電解脫色。此時(shí)改用7%醋酸充裝在液槽中。通電后過剩凝膠之上再加一層大孔凝膠，樣品聚合在*后的另一層凝膠中（圖2）。在我們的試驗(yàn)中省略的染料泳向正極。脫色時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度25伏/厘米，電流10—1 5毫安/管。3—4小時(shí)脫色完畢。增高電壓可以加速脫色。有色的醋酸溶液通過盛有活性炭的漏斗過濾，即可除去染料，重新使丌]。

　6）保存與記錄脫色后的凝膠可以裝在盛彳丁7%醋酸的有塞試管中保存數(shù)年。也可以自然干燥后保存，在需要觀察時(shí)再浸在7%醋酸中溶脹成原來形狀。記錄可以用照相攝影。也可以用光密度計(jì)進(jìn)行捕記。光密度計(jì)的分辨力決定于其狹縫寬窄及光電管放大倍數(shù)。

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