淺談PCR技術(shù)在微生物檢測中的應用前景
摘要：
PCR技術(shù)是一種體外擴增特定DNA序列的方法。該技術(shù)以其高特異性和靈敏度等優(yōu)點已廣泛用于各領域。本文主要對PCR技術(shù)的原理及其在一次性使用衛(wèi)生用品微生物檢測的應用前景等方面進行綜述。
關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；衛(wèi)生用品；微生物；檢測
隨著科學研究的進步，各種新技術(shù)不斷形成且廣泛應用于各個領域。人們對一些生物指標的檢測手段也進入
到了一個新階段．分析研究對象更多的是選擇了DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。PCR (Polymerase Chain Reaction)技術(shù)以其高特異性和靈敏度等優(yōu)點，已廣泛用于醫(yī)學檢驗、水產(chǎn)養(yǎng)殖、環(huán)境監(jiān)測及其他與DNA鑒定相關(guān)的領域。本文主要對PCR技術(shù)的原理及其在一次性使用衛(wèi)生用品微生物檢測的應用前景等方面進行綜述。
1 PCR技術(shù)原理
PCROp聚合酶鏈式反應，是一種體外擴增DNA序列的技術(shù)。現(xiàn)代PCR概念*早是由美國科學家Kary Mullis于20世紀80年代早期發(fā)明的，他也因此榮獲了1993年的諾貝爾化學獎。如今該技術(shù)已成為生物前沿技術(shù)之一。
PCR技術(shù)的基本原理類似于細胞內(nèi)DNA的復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。簡單來說PCR包括變性一退火～ 延伸三個基本反應階段。其基本過程為：①檢測樣品經(jīng)預處理后獲得DNA模板②DNA模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95。C左右一定時間后．使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離后成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為其后階段反應做準備：③模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后．溫度降至55℃左右這時人工合成的弓1物與模板DNA單鏈經(jīng)互補序列配對結(jié)合：④引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在耐熱DNA聚合酶的催化作用下 以4種三磷酸脫氧核苷酸為反應原料，靶序列為模板．按堿基互補配對與半保留復制原則 合成一條新的與模板DNA結(jié)構(gòu)組成相同的新鏈。重復循環(huán)變性一退火一延伸三過程．就可獲得更多的新鏈 而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，一般單一拷貝的基因循環(huán)25-30次DNA便可擴增100萬-200萬倍。PCR反應產(chǎn)物再通過凝膠電脈和基因測序等DNA分析技術(shù)確定擴~~DNA序列的具體信息 。
2 PCR技術(shù)在微生物檢測的應用前景
依據(jù)一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準(標準號：GB15979-2002)中的微生物指標規(guī)定，在一次性使用衛(wèi)生用品中是不能有大腸桿菌以及3種致病性化膿菌(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌)的檢出。該要**對4種菌的定性檢測，標準中用到的檢測方法是傳統(tǒng)的微生物鑒定法，先通過增菌或分離培養(yǎng)．然后進一步根據(jù)各菌群特征做一些鑒定試驗．*后綜合各項結(jié)果判斷。通常這種傳統(tǒng)的檢測方法時間較長，而且在菌量少的情況下易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。而在環(huán)境監(jiān)測、食品檢測等領域中已經(jīng)應用的PCR技術(shù)則可縮短檢測所消耗的時間．且敏感性更高。
2．1大腸桿菌的檢測
相關(guān)研究顯示，通過大腸桿菌特異性引物{上游引物：5 一tgttca gtg gca aga gtt一3 ．下游引物：5 一taatcgata tac ccg ctc一3 )進行PCR擴增可以檢出飲用水中的大腸桿菌．即使在菌量極低的情況下也可以檢出 。但該研究還發(fā)現(xiàn)對于不能夠破壞微生物DNA的**方**造成PCR檢測的假陽性，而GB 15979-2002中對一次性使用衛(wèi)生用品所使用到的**方法通常為環(huán)氧乙烷**、電離輻射**和壓力蒸汽**。而這幾種**方法都會直接破壞微生物的核酸．因．tI：~,PCR技術(shù)用于檢測一次性使用衛(wèi)生用品中致病菌有可行性。
2．2綠膿桿菌的檢測
相關(guān)研究表明使用綠膿桿菌外**A (ETA)基因作為模板來快速檢測綠膿桿菌。ETA基因僅在綠膿桿菌基因
組中存在，_~_Gray[61等人已經(jīng)從一個過量表達ETA的綠膿桿菌菌株中克隆和測定了ETA的結(jié)構(gòu)基因。因此ETA基因可以作為檢出綠膿桿菌的靶基因。根據(jù)ETA基因序列設計特異性引物．通過PCR反應擴增目的基因序列 如果能夠擴增出目的條帶，那就能據(jù)此來確定綠膿桿菌的存在。
2．3金黃色葡萄桿菌和溶血性鏈球菌的檢測
PCR技術(shù)用于檢測金黃色葡萄球菌的研究多數(shù)是關(guān)于食品衛(wèi)生。張亞蘭 的研究將PCR的反應做了優(yōu)化，消除
了一些會影IJ~PCR反應的抑制因素 從而提高檢測方法的靈敏度。同時應用PCR技術(shù)檢測鏈球茵的研究數(shù)據(jù)顯示這
種方法具有可行性 。
3 PCR技術(shù)在應用過程中可能存在的問題
PCR技術(shù)具有較強的靈敏度、準確度和特異性。此外，與傳統(tǒng)的微生物檢測法相I：LPCR技術(shù)能縮短檢測時間，但同時將該技術(shù)引進到衛(wèi)生用品的檢測也存在一些問題。首先，由于檢測樣品是衛(wèi)生用品，在樣品的預處理、樣品DNA的提取等具體的操作過程中可能會遇到不同的問題；其次．盡管PCR反應的步驟很簡單，但是具體的操作是復雜的．如退火溫度的確定、延伸時間的長短以及循環(huán)數(shù)等。因此不同的反應體系應該確定適當?shù)姆磻獥l件以避免假陰性或假陽性等情況的產(chǎn)生。所以要引入PCR技術(shù)來檢測衛(wèi)生用品中的微生物，需要進行預試驗，完善檢測方法
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