核酸雜交技術是根據(jù)兩條互補的核苷酸單鏈可以雜交結(jié)合成雙鏈的原理所建立，用一段已知序列的放射性或非放射性標記的核苷酸單鏈做探針，與待檢標本中的DNA雜交來探查待檢標本中有無與之相互補的核酸。該方法特異性高，但敏感性低于PCR方法。
　　本實驗學習用非放射性標記物-地高辛(DIG)標記DNA片段作探針，用斑點雜交法檢測病原微生物DNA的方法。

　　【原理】—核酸雜交法檢測病原微生物
　　用地高辛（DIG）類固醇半抗原標記特異DNA片段做探針，與待檢標本中DNA雜交，然后加入堿性磷酸酶標記的抗－DIG抗體（抗DIG-AP），再加入堿性磷酸酶的作用底物（NBT/BCIP），若待檢標本中有與探針同源的DNA序列，則探針與其雜交并與抗DIG-AP結(jié)合，堿性磷酸酶催化底物呈色，則在雜交膜上出現(xiàn)蘭色斑點或條帶。該探針可用于斑點雜交，菌落原位雜交及Southern blot雜交。
　?。ㄒ唬〥IG-DNA探針的制備（隨機引物法標記）
　　【材料】
　　1．待標記DNA (0.5~3ug)
　　2．六核苷酸混合物 ( hexanucleotide mix)
　　3．dNTP標記混合物，Klenow enzyme
　　4．其它試劑4M LiCl，無水乙醇，TE溶液（10mMTris-HCl，lmM EDTA PH8.0）；0.2M EDTA pH8.0
　　【方法】
　　1．取待標記DNA(0.5~3ug)，加無菌去離子水至終體積15ul，于沸水浴變性10分鐘后迅速置冰／氯化鈉中冷卻。
　　2．在冰／氯化鈉上添加：
　　2ul 六核苷酸混合物( hexanucleotide mix)
　　2ul dNTP mix
　　1ul Klenow enzyme
　　3．混勻并短暫離心，然后于37℃孵育至少60分鐘。
　　4．加入2ul 0.2M EDTA，pH8.0以中止反應。
　　5．加入2.5ul 4M LiCl及75ul經(jīng)-20℃預冷的無水乙醇，充分混勻， -70℃放置30分鐘或-20℃放置2h。
　　6．12000rpm/min離心15min，用50ul預冷的70％乙醇洗滌沉淀物。
　　7．真空短暫干燥，用50ulTE溶液溶解沉淀。
　　【說明】
　　DIG標記的DNA片斷大小為200~1000bp。每次標準標記反應模板DNA量為0.5~3ug，如標記大量DNA需相應增加反應物和反應體積。若延長37℃孵育時間(到20h)可增加DIG標記產(chǎn)物量。
　?。ǘ┌唿c雜交法
　　【材料】
　　1．硝酸纖維素膜，待檢標本DNA
　　2．標準預雜交液（5× SSC；0.1％月桂酸；0.02％SDS；1／10體積的10倍濃縮阻斷液(含變性并剪切的鮭精DNA)。
　　3．洗液1（2×SSC，0.1%SDS）; 洗液2 (0.1×SSC，0.1 %SDS)。
　　【方法】
　　1．雜交膜的制備
　?、賹拇龣z標本提取的核酸（質(zhì)粒或 染色體DNA）100℃ 10 min 煮沸變性，迅速置冰／氯化鈉中冷卻。
　?、谀さ奶幚恚河?×SSC ，濕潤均勻，37℃烘干后，即可點樣
　?、埸c樣：取變性待檢核酸1ul 點在硝酸纖維素膜（0.45um）上，同 時設陽性和陰性對照，室溫干燥。
　　④80℃真空干燥2h，將DNA固定于膜上。
　　2．預雜交及雜交
　?、兕A雜交：將雜交膜放入裝有適當體積預熱的標準預雜交液的雜交 袋或雜交杯中 ，37℃預雜交 30分鐘，輕輕攪拌使膜在該溫度下孵育。
　　②將DIG標記的DNA探針置沸水浴5min后，迅速用冰水冷卻以變 性DNA探針。
　?、蹖⒆冃缘腄IG標記DNA探針加入到預熱的標準預雜交液(2.5ml／ cm2)中并充分混勻。
　?、軐㈦s交膜放到含DIG標記探針的雜交液中。輕輕攪拌，在68℃ 孵育至少6h（對于檢測微量DNA中的單拷貝基因則需孵育16h）。
　?、蓦s交后洗滌：用足夠量的2×SSC，0.1%SDS室溫漂洗2次，每次5min；用0.1×SSC，0.1%SDS 68℃漂洗2次，每次15min，漂洗過程中需不斷輕輕攪拌。
　　（三）**學檢測—核酸雜交法檢測病原微生物
　　【材料】
　　1．馬來酸緩沖液（0.1M馬來酸，0.15M Nacl。pH7.5）
　　2．洗液（馬來酸緩沖液加入0.3％吐溫20(v/v)）
　　3．阻斷液（10×濃縮的阻斷液經(jīng)馬來酸緩沖液10倍稀釋，新鮮配制）
　　4．檢測液（lM Tri s-HCl，0.1MNaCl，50mM Mgcl2，pH9.5（20℃預熱）
　　5．顯色基底液（加200ul NBT/BCIP濃縮液到10ml檢測液中，新鮮配制）
　　【方法】
　　1．將經(jīng)過雜交和嚴格清洗后的膜用馬來酸緩沖液漂洗1~5min；將膜在l00ul阻斷液中孵育30min。 　　
　　2．用阻斷液稀釋抗D1G抗體至適宜濃度(1：5000左右)。
　　3．傾出封閉液，將膜在20ml抗DIG抗體溶液中孵育膜30min；馬來酸緩沖液洗膜2次，每次15min，再用2m1檢測液平衡膜2~5min。
　　4．將雜交膜在現(xiàn)配制的顯色基底液中孵育，并用塑料袋或盒在暗室中密閉保存（顯色過程中不能搖動）。
　　5．幾分鐘內(nèi)可有顏色沉淀形成（16h完成反應，反應過程中可短暫暴露于陽光下以觀察反應進展）。
　　6．當顏色斑點（或條帶）達到一定強度后，可用50ml去離子水或TE溶液洗膜5min以中止反應。 　　
　　7．顯色后的濾膜可封存于聚乙烯袋內(nèi)或拍照片保存。